Mutagénesis dirigida del conector interdominio ácido FVIIIa3 del factor VIII de la coagulación como estrategia para favorecer la cristalización de sus complejos con la trombina

Contenido principal del artículo

Jeremy Rojas-Murcia
Silvia Arce-Solano
Pablo Fuentes-Prior
Erick Hernández-Carvajal

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares representan una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, lo que se traduce en un fuerte impacto económico en el sector salud. El factor VIII (FVIII) es un cofactor esencial en los procesos hemostáticos que participa en la formación del coágulo ante alguna señal de daño vascular. La proteasa trombina es el principal activador fisiológico del FVIII, pero los mecanismos moleculares de reconocimiento del FVIII por la trombina y la formación de los complejos transitorios Michaelis-Menten correspondientes aún no se han descrito en detalle. La cristalografía de rayos X es una técnica que permite resolver la estructura 3D de complejos proteicos, pero requiere la cristalización previa de la muestra a estudiar. Con el objetivo de favorecer la formación de cristales del FVIIIa3 humano (residuos Glu1649-Arg1689) acomplejado con la trombina, se realizó mutagénesis dirigida para generar los doble-mutantes FVIIIa3 (R1689Q, G1690P) y FVIIIa3 (R1689G, G1690P). Estos fragmentos fueron sobreexpresados de forma heteróloga y purificados, obteniendo rendimientos de ~1.5 mg por cada litro de cultivo bacteriano. Esto permitió generar los complejos proteicos FVIIIa3 (R1689Q, G1690P)•trombina y FVIIIa3 (R1689G, G1690P)•trombina en cantidades suficientes para explorar sus espacios de solubilidad de forma extensiva. En total, en cada caso se evaluaron entre 630 y 820 condiciones de cristalización distintas. A partir de esta búsqueda inicial se obtuvo algún tipo de precipitado cristalino en 22 condiciones, 10 de las cuales lograron ser optimizadas para obtener monocristales de alta calidad para posteriores ensayos de difracción con rayos X.

Detalles del artículo

Cómo citar
Rojas-Murcia, J., Arce-Solano, S., Fuentes-Prior, P., & Hernández-Carvajal, E. (2019). Mutagénesis dirigida del conector interdominio ácido FVIIIa3 del factor VIII de la coagulación como estrategia para favorecer la cristalización de sus complejos con la trombina. Revista Tecnología En Marcha, 32(4), Pág. 39–50. https://doi.org/10.18845/tm.v32i4.4789
Sección
Artículo científico

Citas

[1] A. Timmis et al., “European Society of Cardiology: Cardiovascular Disease Statistics 2017”, Brussels: European Heart Journal, vol. 39, no. 7, pp. 508-579, 2018.
[2] “Enfermedades cardiovasculares”, Organización Mundial de la Salud, 2014.
[3] B. Furie, B y B. C. Furie, “Mechanisms of thrombus formation”, N. Engl. J. Med., vol. 359, no. 9, pp. 938-949, 2008. https://doi.org/10.1056/NEJMra0801082
[4] P. J. Fay, “Activation of factor VIII and mechanisms of cofactor action”. Blood Rev., vol. 18, no. 1, pp. 1-15, 2004. https://doi.org/10.1016/S0268-960X(03)00025-0
[5] P. W. Rose et al., “The RCSB Protein Data Bank: views of structural biology for basic and applied research and education”, Nucleic Acids Res., vol. 43, no. D1, pp. 345-356, 2014. https://doi.org/10.1093/nar/gku1214
[6] B. Rupp, “Biomolecular crystallography: principles, practice, and application to structural biology”, Garland Science, 2009.
[7] E. Hernández-Carvajal et al. “Producción heteróloga y caracterización bioquímica del procoagulante humano Factor VIII para ensayos de cristalización de macromoléculas proteicas”, Tecnol. Marcha, vol. 29, no. 4, pp. 78-91, 2017. 
http://dx.doi.org/10.18845/tm.v29i4.3039
[8] A. Rath et al., “Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 106, no. 6, pp. 1760-1765, 2009. https://doi.org/10.1073/pnas.0813167106
[9] Y. Shi et al., “Abnormal SDS-PAGE migration of cytosolic proteins can identify domains and mechanisms that control surfactant binding”, Protein Sci. vol. 21, no. 8, pp. 1197-1209, 2012. https://doi.org/10.1002/pro.2107
[10] G. C. Lander, H. R. Saibil y E. Nogales. “Go hybrid: EM, crystallography, and beyond”, Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 22, no. 5, pp. 627-635, 2012. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2012.07.006
[11] A. P. Turnbull y P. Emsley, “Studying protein-ligand interactions using X-ray crystallography”. Protein-Ligand Interactions: Methods and Applications, pp. 457-477, 2013. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-398-5_17
[12] K. Nogami et al., “Thrombin-catalyzed activation of factor VIII with His substituted for Arg372 at the P1 site”, Blood, vol. 105, no. 11, pp. 4362-4368, 2005. https://doi.org/10.1182/blood-2004-10-3939